3.9. Densidad de nervaduras

Las redes de nervaduras son las encargadas del transporte de agua, carbono y nutrientes en la hoja. La densidad de las nervaduras y la longitud de las nervaduras menores por unidad de área foliar (mm mm-2) se pueden usar para caracterizar la estructura de estas redes. La densidad de las nervaduras determina la conductancia hidráulica y la tasa fotosintética. Dependiendo del grupo de especies considerado, la densidad de nervaduras puede correlacionarse con otros caracteres foliares, tales como el espesor foliar, la densidad de estomas y la tasa máxima de intercambio de gases. Este carácter muestra plasticidad a lo largo de los ambientes dentro de una especie y es altamente variable entre especies, mostrando tanto tendencias fliogenéticas amplias como potenciales adaptaciones a los gradientes de recursos.
Para la medición de este carácter pueden utilizarse hojas frescas o secas (ver protocolo de recolección de hojas en 3.1.). La intensidad del muestreo debe tener en cuenta la variación conocida entre las hojas al sol y a la sombra, y a lo largo de la lámina de hojas determinadas. Si es posible, las mediciones deben hacerse en las secciones de la lámina que no contienen venas grandes. Para hojas más pequeñas, usar la hoja entera, Para hojas más grandes, una sección de 1 cm2 es suficiente.


Mediciones

Remojar la hoja en 5 % p/v NaOH/H2O por 24-72 horas o hasta que se vuelva transparente. Si la solución se vuelve de un color marrón opaco durante el remojo, reemplace la solución de remojo. Luego enjuague la hoja en H2O y transfiera a una solución al 2% p/v NaOCl/H2O por 5-30 minutos o hasta que se haya desteñido.

Enjuagar la hoja en H2O y transferir deshidratando progresivamente a etanol puro (por ej, 30%, 50%, 70%, 100% etanol, cada paso debe durar 30 segundos, para hojas más tiernas; hasta 5 minutos para hojas más duras). Teñir la hoja por 15 minutos en 1% p/v safranina O en etanol y/u otro colorante para ligninas. Desteñir en etanol. Luego la hoja puede ser montada en agua o glicerol en láminas transparentes de plástico, o en preparados permanentes, luego de la transferencia con 100% tolueno, en inmersión con aceite o Permount (luego del montaje dejar el preparado varios días en reposo para permitir la total evaporación del tolueno antes de realizar las mediciones). Las nervaduras aparecerán teñidas en rojo. Previo a la medición asegurarse que todas las nervaduras de la red sean visibles. Las nervaduras menores, que son más numerosas y funcionalmente muy importantes, pueden ser muy difíciles de ver, y a menudo requieren remover la cutícula para una visualización más precisa. El conteo de las nervaduras debe ser hecho utilizando objetivos microscópicos de 4x para helechos y hasta de 40x para angiospermas. Fotografiar la red de nervaduras utilizando una luz microscópica, asegurando un campo de visión lo suficientemente grande (por ej., 1-10 mm2). Luego medir la longitud total de las nervaduras en la imagen y dividir ese número por el área de la imagen para obtener la densidad de las mismas, utilizando un software de análisis de imagen (ver 3.1). Este proceso de análisis de imagen puede ser semiautomatizado con los softwares libres disponibles (ver Mas sobre metodología más adelante) pero la precisión debe ser testeada.


Casos especiales y extras

(i) Manipulación de las hojas: Las hojas se vuelven delicadas durante el proceso de tinción y montaje, por lo que deben ser manipuladas cuidadosamente entre soluciones. De ser necesario la solución debe ser aspirada del recipiente que la contiene, de forma que no se produzcan perforaciones o desgarros en la lámina. Para mejores resultados, los detalles del protocolo de enjuague de las hojas pueden ser modificados de acuerdo a las características particulares de las diferentes especies. Por ejemplo, se puede utilizar Na tibio (nunca hirviendo), y enjuagar varias veces, y una solución más fuerte de NaCl/H2O por un período de tiempo más corto. Las hojas pequeñas o delgadas pueden requerir menos tiempo de remojo en todas las soluciones. Por el contrario, hojas muy gruesas o densas pueden requerir varios días en la solución de NaOH antes de volverse transparentes. Las hojas peludas pueden requerir que se remueva la epidermis.

(ii) Esclereidas. En algunas especies, las hojas pueden tener esclereidas (que también tienen una función hidráulica muy importante) y que pueden ser confundidas con nervaduras. En estos casos o en otros particulares, puede ser necesaria la medición de caracteres adicionales de nerviación, para investigaciones más detalladas de estructura y función de la hoja (ver referencias más adelante)
Referencias sobre la teoría y significado: Uhl and Mosbrugger (1999); Roth-Nebelsick et al.(2001); Sack and Frole (2006); Sack and Holbrook (2006); Brodribb et al. (2007); Boyce et al.(2009); Brodribb et al. (2010).

Más sobre metodos: Dilcher (1974); Gardner (1975); Brodribb and Feild (2010); Price et al. (2011).