3.1. Area foliar específica

El Área Foliar Específica (AFE o SLA por sus siglas en inglés) es el área de una hoja fresca dividida por su peso seco. Nótese que masa foliar por área (MFA o LMA por sus siglas en inglés), masa foliar específica (MFE) y peso foliar específico (PFE) son simplemente 1/AFE. El AFE es comúnmente utilizado en análisis de crecimiento debido a que generalmente se correlaciona de manera positiva con la Tasa de Crecimiento Relativo (TCR o RGR por sus siglas en inglés). El AFE tiende a relacionarse de manera positiva con la tasa fotosintética bajo condiciones de saturación de luz (ver Sección 3.10) y con el contenido foliar de nitrógeno (N) (ver Sección 3.6), y negativamente con la longevidad de hoja (ver Sección 3.8) e inversión en compuestos carbonados secundarios de importancia cuantitativa, como son los taninos o la lignina. Las especies de ambientes ricos en nutrientes de modo permanente o temporario (por ejemplo, los desiertos luego de un evento de lluvias) tienden a mostrar en promedio valores de AFE mayores que aquellas especies que crecen en ambientes pobres en recursos. Sin embargo, puede haber una variabilidad considerable entre especies que coexisten en un mismo ambiente.

El área foliar específica es una función del contenido de materia seca foliar (CMSF o LDMC por sus siglas en inglés) y del espesor de la hoja (ver Secciones 3.3 y 3.4, respectivamente). Ambos componentes pueden contribuir al AFE en diferentes grados, dependiendo del grupo de plantas considerado y del hábitat en el que crecen. En bases de datos con especies herbáceas de climas templados, el valores bajos de AFE en las especies de crecimiento lento están relacionado con valores altos de CMSF, más que con valores altos de espesor de hoja. En bases de datos con dominancia de especies leñosas perennifolias, en cambio, el espesor de la hoja puede tener el mismo grado de influencia que el CMSF sobre el AFE. Por su parte, algunas especies (por ejemplo del género Oxalis) que crecen normalmente en microhábitats muy sombríos (y por lo tanto presumiblemente con limitación de recursos) tienen valores altos de AFE al mismo tiempo que poseen bajo espesor de hoja.

En zonas con severas limitaciones de nutrientes son comunes las especies de plantas de crecimiento lento, con hojas esclerófilas (con cutículas y paredes epidérmicas gruesas, muy esclerificadas y con una alta relación entre fibra cruda y proteínas). En ellas los valores bajos de AFE están más asociados a valores altos de CMSF que a valores altos de espesor de hoja. En contraste con esto, en las plantas suculentas que son comunes en zonas secas tropicales o subtropicales estacionales, un bajo AFE se asocia con un bajo CMSF y un alto espesor de hoja. Como consecuencia de estas variaciones, el AFE y sus componentes no siempre están relacionadas de un modo simple entre sí y con gradientes de productividad. Por lo tanto, recomendamos la medición adicional de las dos variables relacionadas, CMSF y espesor, cuando se mide AFE.


¿Qué recolectar y cómo hacerlo?

Recomendamos elegir hojas relativamente jóvenes (presumiblemente más activas fotosintéticamente), pero que estén totalmente expandidas y endurecidas, provenientes de individuos adultos (a menos que el estudio esté focalizado específicamente en plántulas, hojas en desarrollo u hojas senescentes). Siempre que sea posible, evitar hojas con signos de ataque de herbívoros o patógenos, o con una cobertura importante de líquenes, musgos, etc. El AFE es fuertemente afectado por la intensidad de luz. Por lo tanto, para muchas preguntas de investigación (por ejemplo en la comparación general de individuos y especies) es mejor muestrear hojas en la parte externa de la copa (también llamadas hojas “asoleadas”) de plantas creciendo bajo las mejores condiciones posibles.
Para especies que crecen típicamente en el sotobosque, tomar hojas de las partes de la planta más expuestas a la luz solar. Para especies umbrófilas (aquellas que nunca crecen expuestas a luz solar directa), juntar muestras de las partes de la planta más expuestas a la luz, pero evitando aquellas que aparezcan dañadas, estresadas o descoloridas por exceso de irradiación). El raquis (nervadura central similar a un tallo en hojas compuestas) y todas las nervaduras son considerados parte de la hoja para una medición estandarizada de AFE (no obstante, puede encontrar una discusión sobre este tema, y sobre si los pecíolos deben ser incluidos en la medición de AFE, en Casos especiales o extras de la presente Sección). Recomendamos juntar ramitas enteras con las hojas aún unidas y no separarlas hasta justo antes de medirlas.


Almacenamiento y procesamiento

Las plantas en el campo pueden encontrarse en un grado desconocido de deshidratación. Esta deshidratación puede generar una contracción de las hojas y, por lo tanto, una medición poco confiable del AFE (ver Casos especiales o extras en la presente Sección). Este problema se presenta con mayor importancia en hojas blandas de altos valores de AFE, y es menos importante en hojas esclerófilas, de bajos valores de AFE. Idealmente, las muestras (ramas con las hojas unidas) deben ser cortadas y colocadas rápidamente en frascos o tubos de ensayo, con el extremo cortado sumergido en agua destilada. Si esto no fuese posible, entonces envuelva las muestras en papel humedecido, y colóquelas en bolsas plásticas selladas. En este caso, exhale en la bolsa antes de cerrarla, para asegurar una concentración de dióxido de carbono y humedad del aire que minimicen la pérdida de agua por transpiración. Guarde la bolsa en la oscuridad. Los tejidos de algunas especies xerófilas (por ej. Bromeliáceas, Cactáceas, algunas especies con hojas muy pequeñas y resinosas) se pudren muy rápidamente bajo condiciones de humedad y calor, por lo que es mejor conservarlas secas, en bolsas de papel. Ante la duda (por ej. en especies medianamente suculentas) y si recolectar material en otra oportunidad es difícil, recomendamos recolectar el material de ambas maneras, y utilizar las hojas guardadas en bolsas de papel si aquellas conservadas en bolsas plásticas se descompusieron.

Guardar las muestras recolectadas en una conservadora o heladera (nunca en un freezer) en la oscuridad, hasta el momento de procesamiento en laboratorio. Si no se dispone de conservadora y la temperatura es alta, es mejor guardar las muestras en bolsas plásticas sin agregar humedad. Medir tan pronto como sea posible luego de la recolección y rehidratación, preferentemente dentro de las 24 hs. Si el almacenamiento por más de 24 horas es inevitable, entonces debe hacerse entre 2 y 6ºC para evitar la descomposición.

Para la mayoría de las plantas es preferible la rehidratación. En el caso de hojas que hayan sido recolectadas “en seco” (bolsas de papel) o para especies de hojas muy blandas (que poseen valores de AFE mayores que 10–15m2 kg–1), la rehidratación es fundamental. Si la rehidratación descripta arriba no fuera posible, entonces las muestras deben colocarse en bolsas plásticas cerradas (con o sin agregar papel húmedo en su interior) por 12 horas. Debe tenerse en cuenta que este último procedimiento puede implicar, en ciertas ocasiones, que algunas especies presenten valores de AFE ~5% menores que aquellas sometidas a rehidratación completa. Especies suculentas y xerófilas no deben rehidratarse por más de 6 horas, con ninguno de los métodos. Si ninguno de los procedimientos de rehidratación funciona, se recomienda colectar las muestras de estas especies en la mañana, luego de un evento de lluvia, o unas pocas horas después de un riego abundante.


Mediciones

Cada hoja (incluyendo o excluyendo el pecíolo, ver casos especiales y extras debajo en esta Sección) es separada del tallo y cuidadosamente secada antes de la medición. El área proyectada (como en una fotografía) puede ser medida con medidores especializados de área, como los desarrollados por Delta-T Devices (Cambridge, UK) o LI-COR Q3 (Lincoln, Nebraska, USA). Siempre calibre el medidor de área usando piezas de tamaño conocido antes de medir las hojas, y siempre corrobore (por ej., en el monitor) que la hoja está en posición completamente plana y dentro del área de escaneo. Si va a usar un medidor de AF portátil, asegúrese de que el error de estimación no es demasiado alto para sus objetivos, haciendo una prueba preliminar con áreas foliares escaneadas en el laboratorio, usando un rango de diferentes tamaños de hojas.

Las imágenes de las hojas también pueden ser obtenidas (capturadas) en el campo o laboratorio y guardadas para ser procesadas con posterioridad, por ej. con una cámara digital. Para ello las hojas se acomodan cuidadosamente sobre una superficie de vidrio. La inclusión de una escala o un objeto de tamaño conocido en la imagen permiten calibrar el tamaño. El mejor resultado se obtiene con una cámara montada en un trípode, con dos lámpara alumbrando desde los laterales y sin usar flash.
Una tercera opción es determinar el AF con un escáner de escritorio (con la ventaja de que muchos escáneres pueden alimentarse de energía de una laptop, a través de una conexión USB). Recomendamos escanear en modo color para obtener la mayor información de la imagen y poder discriminar la hoja del fondo. Los escáneres a color también permiten el análisis a posteriori de otras características de interés. En todos los casos, asegurarse que las hojas no están enrolladas ni superpuestas entre sí. Intente poner las hojas tan planas como sea posible, en una posición que permita captar el máximo de sus superficies, pero sin aplastarlas para que el tejido no sea dañado. En algunos casos, cortar las hojas en porciones menores facilita su aplanamiento. En ambos casos, el AF puede ser analizada con un programa de análisis digital de imágenes. Algunos programas gratuitos son Leafarea (A. P. Askew, University of Sheffield, UK, descargable en la sección “herramientas” desde el sitio web de Nucleo DiverSus, ver Caja 1) para otros análisis más complejos que incluyan otros órganos de las plantas, pueden usarse los programas ImageJ (del US National Institutes of Health; http://www.nih.gov) y GIMP (GNU Project; http://www.gnu.org/).

Transforme la imagen al modelo de color HSV para una mejor separación entre el fondo y la hoja. Más detalles sobre el procesamiento de imágenes pueden encontrarse en Prometheus Wiki (ver Caja 1). Luego de la medición del área, poner la muestra en estufa (láminas y pecíolos juntos o por separado, dependiendo del objetivo, ver casos especiales o extras en la presente Sección), idealmente a 70ºC por 72 horas, o a 80ºC por 48 horas (evitar temperaturas mayores); luego determinar el peso seco. Tenga en cuenta que, una vez sacadas del horno, las muestras absorberán algo de humedad del aire. Póngalas en un desecador con sílica gel, o bien de nuevo en el horno, hasta el momento de pesarlas. Cuando se trata de hojas pequeñas, se puede mejorar la exactitud de la medición pesando varias hojas juntas como si fueran una sola y luego dividiendo el peso por el número de hojas. Cuando se conviertan valores de AFE a MFA o viceversa, siempre hágalo para cada réplica individual, más que para el promedio de varias réplicas.


Casos Especiales o Extras

(i) Pecíolos. Un punto importante es si los pecíolos deben o no ser incluidos en las mediciones de AFE. La decisión depende de los objetivos del estudio. Algunos autores consideran que el pecíolo es una parte integral de la hoja porque al momento de la abscisión éste cae junto con la lámina y porque provee un soporte y un sistema vascular sin el cual la hoja no podría sobrevivir. Por lo tanto, incluyen al pecíolo en la medición de AFE. Otros autores consideran que el pecíolo no debe ser incluido en la medición de AFE, porque su principal función es e posicionamiento espacial y soporte hidráulico de la hoja, siendo por lo tanto equivalente al tallo mientras que la principal función de la lámina es la intercepción de luz y la fijación de C. El porcentaje del peso seco representado por el pecíolo varía desde el 0% hasta casi el 50%; por lo tanto la inclusión o no del mismo puede modificar el valor de AFE drásticamente. Aunque la inclusión o no del pecíolo puede muchas veces no ser crucial en un estudio en particular, puede representar una fuente de error sistemático e importante cuando se comparan resultados de diferentes estudios, o aun en comparaciones de especies de un sitio con muy diferentes estructuras foliares. Por lo tanto, lo mejor (aunque requiere más tiempo) es medir láminas y pecíolos por separado, de manera que el AFE puede ser calculada de ambas maneras con una misma muestra, facilitando la comparabilidad con otros estudios. Si se usan imágenes digitales, sugerimos escanear o fotografiar los pecíolos y el resto de la hoja en la misma imagen, pero en sectores diferentes, de manera tal que puedan ser tratados en conjunto o por separado; luego pesar los pecíolos por separado del resto de las hojas de la misma réplica. Tome la decisión que mejor se ajuste a sus objetivos, pero posteriormente explicite en su publicación y en sus planillas de datos si los pecíolos fueron incluidos o no en los cálculos.

(ii) Hojas compuestas. Algunas veces las hojas poseen un AFE menor debido a sus raquis gruesos. La decisión de incluir o no a los raquis y los pasos prácticos en cada caso son similares que para los pecíolos (ver punto 1, arriba). Como opción por defecto, recomendamos considerar al raquis como parte de la hoja para el cálculo de AFE, indicando esto claramente en la publicación del estudio. Tenga presente que en algunas especies, el raquis puede ser más de 10 veces más pesado que la suma de los folíolos. Otra decisión a tomar en el caso de hojas compuestas es si se considera el valor de un folíolo independiente y representativo o si se toman todos los folíolos de manera conjunta. Como en el caso del raquis y del pecíolo, la decisión depende de os objetivos y, nuevamente, se recomienda especificar cuál fue el criterio, al momento de publicar los resultados. Cada vez que sea posible, registre el área de folíolos individuales y también el área total de la hoja.

(iii) Contracción del AF. Las hojas disminuyen su tamaño cuando se deshidratan. La contracción se define como un porcentaje, calculado como 100 x (1 - área seca/área saturada). La contracción en promedio es del 20%, pero puede alcanzar el 80%, dependiendo de la especie. La máxima contracción de área refleja diferencias estructurales y se correlaciona con otros caracteres de hoja incluyendo conductancia cuticular, parámetros de presión-volumen como el módulo de elasticidad y punto de pérdida de turgencia, contenido de materia seca foliar (CMSF) y espesor de hoja, así como forma de crecimiento y el grado de caducidad. La contracción del AF es tanto un potencial problema (que genera desvíos en mediciones de área foliar en herbarios y fósiles) como un carácter fácilmente medible que refleja múltiples propiedades hidráulicas y estructurales de las hojas. Para medir este carácter, recoja y mida hojas siguiendo el mismo protocolo que para AF y CMSF. Mida el AF proyectada fresca. Corte la hoja en porciones menores en caso de que la misma no sea plana. Este paso es muy importante porque algunas hojas presentan muy poca contracción, por lo que garantizar la medición precisa del área en fresco es crucial. Luego seque la muestra en estufa, aplastada de forma plana en sobres o en una prensa. Mida el área de la hoja seca, procurando que esté en la misma posición que se usó para el área en fresco. Esto será muy difícil o imposible para algunas hojas aciculares; en hojas muy gruesas será necesario cortar previamente varias porciones planas. Luego de esto, calcular la contracción con la fórmula dada anteriormente.

(iv) Área Foliar total vs. Área Foliar Proyectada. En hojas “estándar”, el AF se mide como el AF proyectada de una cara de la hoja. No obstante, en hojas que no son planas, el AF proyectada es menor que el AF total. El AF proyectada está relacionada con la intercepción de luz, mientras que el AF total se relaciona con la cantidad de tejido fotosintéticamente activo. Existen, sin embargo, casos como el enrollamiento de lámina en los pastos, donde tanto la intercepción de luz como el intercambio gaseoso se reducen. Claramente la medición a realizar depende de las preguntas, aunque el conocimiento de ambas permite una visión más abarcativa.

(v) Hojas aciculares. Las hojas aciculares son un caso específico donde el AF total y el AF proyectada no coinciden. El AF proyectada puede ser medida siguiendo los pasos normales; no obstante, debido a que estas hojas son generalmente finas, debe tenerse especial precaución en que el instrumental utilizado tenga suficiente definición. Para una medición gruesa, se puede medir la longitud de la hoja y su ancho con un calibre, y luego multiplicar 2 x largo x ancho.

(vi) Hojas diminutas. Las hojas verdaderas de algunas especies (por ej. Callitris sp.) tienen escamas finas ensambladas apretadamente en estructuras semejantes a ramitas. En estos casos, debe considerarse a las mismas como análogas a una hoja, ya que están agrupadas como una unidad.

(vii) Hojas de gramíneas y plantas similares. Usualmente sólo se considera la lámina, excluyendo la vaina. Sin embargo, así como para el caso de los pecíolos, (ver punto 1), la decisión sobre qué medir depende de los objetivos. Muchas especies tienen hojas que tienden a enrollarse o rotar. En esos casos, es más fácil trabajar cortando pedazos de la hoja, en fragmentos de 5-10 cm.

(viii) Plantas suculentas y áfilas. Para plantas cuyos órganos fotosintéticos no son hojas verdaderas, recomendamos tomar la porción de la planta que sea su análogo funcional. Para especies con espinas fotosintéticas o tallos no suculentos (por ej. Ulex, Senna aphylla), esto puede significar tomar los últimos 2 cm de una rama joven. Para Cactáceas y otras suculentas, recomendamos tomar toda una hoja o su equivalente (poir ej. un cladodio joven en Opuntia) siempre que sea posible. A veces esto trae algunos problemas prácticos, por ejemplo con hojas completas de Agave o costillas de Cactáceas columnares, dado que son difíciles de colectar y de procesar por su gran tamaño. En estos casos, es conveniente tomar muestras (de tamaño conocido) de hojas maduras (por ej. En Agave) o “costillas” (en cactus) que incluyan epidermis y mesófilo en ambas caras, más el parénquima interno. Aunque este parénquima no siempre contiene clorofila, y algunos autores sugieren que por lo tanto no debe ser considerado en cálculos de AFE, posee un rol fundamental en el metabolismo CAM de las plantas suculentas, por lo que también tiene sentido incluirlo (ver Sección 3.1 ). Los tallos jóvenes de algunas graminoides de otras familias (Eleocharis, Juncus), las “ramitas” laterales de las colas de caballo (Equisetum), y otros similares también deben ser considerados como hojas. Debido a que muchas de estas especies ocurren en un amplio rango de ambientes, es bueno explicitar el método utilizado en cada caso.

(ix) Helechos. Pare los helechos, sólo colecte los frondes (las “hojas”) sin los soros productores de esporas, los cuales normalmente se observan como estructuras verdes o marrones, con formas variadas, en el envés o en los márgenes del fronde.

(x) Hojas de árboles altos. Utilizar, preferentemente, las hojas expuestas al sol en la parte más alta de la copa. Si éstas no pueden ser alcanzadas, algunas personas utilizan hondas, armas de fuego o los servicios de escaladores profesionales. En árboles no tan altos una alternativa es considerar las hojas externas expuestas a la luz de la mitad de la copa (las hojas internas son normalmente más viejas) las cuales pueden alcanzarse con tijeras o podadoras montadas en varas extensibles.

(xi) Hojas muy grandes. Una vez colocadas en bolsas plásticas, las hojas grandes pueden ser colocadas en carpetas de tapas duras para evitar que se doblen y arruguen. Si las hojas son más grandes que el escáner, cortar las hojas en partes más pequeñas y medir la sumatoria de las áreas de estos fragmentos. Las hojas con nervaduras y venas muy grandes pueden producir una sombra que sobreestime el AF. En este caso, debe cortarse la nervadura hasta la altura de la superficie de la lámina y escanear la hoja sin esta porción, la cual debe luego incluirse nuevamente en el sobre que va a estufa para la medición del peso seco. En el caso de un raquis grueso, retire el raquis y medir su diámetro y la longitud hasta la mitad, y calcular el área del raquis como el producto de los dos. Luego escanee las hojas sin raquis, pero incluyendo el raquis en el peso seco. Si decide utilizar submuestras y no la hoja entera, asegúrese que sean representativas de la variación de AFE en toda la hoja.

(xii) Plantas con heteromorfismo foliar. En caso de especies con 2 o más tipos de hojas, con diferentes anatomías y formas, por ejemplo en especies con hojas en roseta y en las varas de floración, juntar hojas de ambos tipos, en proporciones representativas a su presencia en la planta, para obtener un valor representativo de AFE.

(xiii) Opciones simples (“low tech”) para medir AF y AFE en el campo. Existen situaciones en las que no es posible llevar hojas frescas del campo al laboratorio para el escaneo, o los escáneres portátiles no pueden ser llevados o alimentados con electricidad en el campo. Una solución a este problema es la utilización de cámaras digitales para la obtención de imágenes del área de la hoja (ver Medición, más arriba). Otra opción práctica es obtener fragmentos de hojas de área conocida, por ejemplo por medio de una perforadora o sacabocado, evitando venas gruesas y poniendo los fragmentos en un sobre para que su posterior secado (tomar varias muestras por réplica, debido a que tienden a pesar muy poco). Este es un método rápido y barato para comparar láminas. Sin embargo, sobrestima el AFE en comparación con mediciones que toman toda la hoja, particularmente en hojas grandes de nervaduras y pecíolos gruesos. Por lo tanto, valores de AFE obtenidos con este método no pueden ser comparados con otros obtenidos a partir de hojas completas, a menos que exista una buena calibración. Otra opción es obtener el área en plástico o papel (copiando el contorno de la hoja) y posteriormente medir el área de estos “moldes”, en el laboratorio. Este método es bueno para hojas medianas o grandes, hojas enteras y hojas que no son muy angostas (por ej. no podría aplicarse a pastos xerófilos).

 
Referencias sobre teoría, significado y bases de datos: Reich et al. (1992, 1999); Garnier and Laurent (1994); Poorter and Garnier (1999); Wilson et al. (1999); Castro-Díez et al. (2000); Niinemets (2001); Westoby et al. (2002); Díaz et al. (2004); Paula
and Pausas (2006); Wright et al. (2007); Poorter et al. (2009); Hodgson et al. (2011); Blonder et al. (2012); Juneau and Tarasoff (2012).

Más sobre métodos: Chen and Black (1992); Garnier et al. (2001a, 2001b); Vendramini et al. (2002); Vile et al. (2005); Niinemets et al (2007).