3.14. Pérdida de electrolitos como indicador de la sensibilidad a las heladas

La cantidad de electrolitos que se pierden luego de que la hoja ha sufrido congelamiento es un indicador de la sensibilidad de un tejido las heladas y está relacionada con el clima en el cual la especie se desarrolla. Las hojas de las especies que habitan regiones cálidas, y/o que crecen en los sitios más cálidos a lo largo de un marcado gradiente climático regional, exhiben hojas con una mayor sensibilidad a las heladas, que aquellas especies de regiones más frías, y/o que crecen en los ambientes más fríos a lo largo de un gradiente regional. La técnica aquí descripta está basada en la idea de que cuando una célula o tejido experimenta un marcado estrés térmico, uno de los primeros síntomas que manifiesta es la disrupción de la permeabilidad de las membranas celulares, eliminando la capacidad de las células de retener solutos, tales como los iones. La pérdida de iones desde un tejido puede ser fácilmente evaluada, a través de la medición de los cambios en la conductividad de electrolitos de una solución que baña a los tejidos. La técnica es aplicable a un amplio rango de tipos de hojas (desde hojas tiernas a esclerófilas), taxa (monocotiledóneas, dicotiledóneas, etc.) y, no se ve afectada por el espesor de la cutícula.


¿Qué recolectar y cómo hacerlo?

Recolectar hojas jóvenes, maduras, con la mayor exposición solar posible, sin signos de herbivoría o daños producidos por patógenos (ver 3.1). Cuando la recolección se torna más complicada, la respuesta dependerá de la pregunta a responder, aunque en la mayoría de los casos la recolección debería estar estandarizada para todas los taxa considerados en esta medición. Dependiendo de la pregunta de interés, recolectar las hojas durante el pico de la temporada de crecimiento (ver 3.1.), o preferentemente cerca del fin de la temporada (ver Casos Especiales o Extras) o en invierno (para especies perennifolias).

Si una especie crece a lo largo de un gradiente ambiental amplio, y el objetivo es una comparación interespecífica, las hojas deberían ser recolectadas en el sitio donde la especie es más abundante(ver sección 1.1). Además, si el estudio contempla comparar muchas especies, es conveniente recolectar las muestras en el menor intervalo de tiempo posible, para minimizar diferencias debido a la aclimatación que pueden presentar las hojas como consecuencia de cambios en las condiciones meteorológicas que pueden ocurrir en días o semanas. Recolectar hojas de al menos cinco individuos adultos, elegidos al azar, por cada especie.


Almacenamiento y procesamiento

Las hojas recolectadas deben ser almacenadas en una conservadora o heladera hasta que sean procesadas en el laboratorio (ver 3.1.). Con la finalidad de minimizar los procesos naturales de senescencia, las muestras deben ser procesadas el mismo día de su recolección. Por cada planta, con un sacabocado, obtener cuatro discos foliares de 5 mm de diámetro, evitando las venas principales. A los discos foliares se les aplicaran dos tratamientos distintos, utilizando dos discos foliares en cada uno (ver más abajo en este protocolo). En el caso de hojas aciculares, cortar fragmentos del tejido fotosintéticamente activo que sumen un área foliar similar a los disco de 5 mm de diámetro. Las muestras deben ser enjuagadas durante 2 horas en agua destilada en un agitador. Luego, secar dos discos (o su equivalente en fragmentos de área foliar) y sumergirlos en un tubo Eppendorf con un 1 ml de agua destilada. Es importante que los discos estén completamente sumergidos. Para cada tratamiento, preparar tantas replicas como el número de plantas recolectadas (1 replica equivale a 2 tubos, en el cual, cada uno contiene 2 discos o su equivalente en fragmentos de hojas).

Mediciones
Aplicar los siguientes tratamientos, sin aclimatación previa, a las dos muestras de disco o fragmentos de hojas en los respectivos tubos: (1) tratamiento control:incubar a 20 ºC (o a temperatura ambiente, lo más estable que sea posible); y (2) tratamiento de congelamiento: incubar a -8 ºC (en un congelador calibrado). Las incubaciones deberían realizar durante 14 horas en completa oscuridad, para evitar alguna reacción inducida por la luz.

Después de la incubación, dejar que las muestras alcancen temperatura ambiente y medir la conductividad de la solución. Para medir la conductividad se debe tomar una muestra de la solución del tubo Eppendorf y colocarla en un medidor de conductividad estándar, previamente calibrado, como el Horiba C-172®. Luego, registrar la conductividad de la solución. A continuación, sumergir los tubos Eppendorf, de ambos tratamientos, en agua hirviendo durante 15 minutos, con la finalidad de desnaturalizar las membranas celulares y liberar todos los solutos en la solución del tubo Eppendorf. Finalmente, volver a medir la conductividad. Antes de la inmersión, perfore la tapa de cada uno de los tubos Eppendorf, para que se pueda liberar la presión durante la ebullición.


Cálculos:

1. Porcentaje de fuga de electrolitos (PEL): en cada una de las plantas calcular, para el control y el tratamiento de congelamiento:
PEL = (es / et) × 100

Donde es, es la conductividad de una muestra inmediatamente después del tratamiento y, et es la conductividad después de hervir la muestra. Altos valores de PEL indican una desnaturalización significativa de las membranas y, por lo tanto, daño celular. Mientras mayor sea PEL, mayor es la sensibilidad de las hojas medidas al congelamiento.

2. PEL corregido: los valores de PEL del tratamiento control pueden variar entre especies como consecuencia de diferencias intrínsecas en la permeabilidad de las membranas, la manipulación experimental y de las lesiones celulares resultantes de la obtención de los discos o los fragmentos de hojas. Para controlar estas y otras posibles fuentes de error, a cada una de las réplicas, se debe restar el PEL del tratamiento control al tratamiento de congelamiento. De ahí que el PEL corregido sea:
PEL corregido = PEL del tratamiento de congelación – PEL del tratamiento control

Para el cálculo de la media, desvió estándar o error estándar, de cada una de las especies, el PEL corregido obtenido de cada una de las plantas es considerado como una unidad de observación estadística o replica.

Casos Especiales o Extras

(i) Aplicación a diferentes formas de vida o formas de crecimiento: La técnica aquí descripta no es aplicable a plantas halófitas y suculentas. Además, esta técnica no necesariamente es aplicable a plantas deciduas o hemicriptofitas, ya que sus adaptaciones para tolerar las heladas se relacionan con la anatomía del leño y la producción de botones foliares, más que con adaptaciones de las hojas. En estos últimos casos?, la fuga de electrolitos posiblemente podría ser evaluada tomando secciones de los tallos, aunque la fiabilidad de este método no ha sido todavía evaluada, hasta nuestro conocimiento, como lo ha sido en hojas.

(ii) Temporada de recolección. Debido a que existe una aclimatación a las bajas temperaturas a medida que las temperaturas descienden, es recomendable realizar la recolección de las hojas cerca o al final de la temporada de crecimiento.

(iii) Aclimatación. La ocurrencia de aclimatación en respuesta a heladas moderadas podría ser detectada utilizando la técnica aquí descripta, con el tratamiento a -8 ºC, con hojas recolectadas en sucesivas fechas entre verano y otoño.

(iv) Sensibilidad a altas temperaturas. Para estimar la sensibilidad a altas temperaturas inusualmente altas (ca. 40ºC), se puede usar la misma técnica básica, con una modificación en el tratamiento con temperatura.

(v) Sensibilidad al frío. Ésta es una limitante fisiológica con importancia ecológica en ambientes montañosos de bajas latitudes, la cual podría ser detectada mediante el uso de esta técnica con un pequeño ajuste de la temperatura de tratamiento. Se recomienda realizar una incubación durante 24hs o más, a alrededor de +5ºC, por ej. en una heladera común. En su defecto, se podría utilizar un baño de agua destilada (o agua de lluvia) a 0ºC, ya que esta técnica no congelaría realmente los tejidos vegetales. Un tejido con sensibilidad al frío liberaría electrolitos después de la incubación, mientras que uno tolerante al frío no lo haría.


Referencias sobre teoría, significado y bases de datos: Levitt (1980); Blum (1988); Earnshaw et al. (1990); Gurvich et al. (2002).

Más bibliografía sobre métodos: Earnshaw et al. (1990); Gurvich et al. (2002).