3.12. Vía metabólica fotosintética

En las plantas terrestres operan tres vías metabólicas fotosintéticas principales, cada una con sus particularidades bioquímicas: C3, C4 y CAM (Metabolismo ácido de las Crasuláseas, CAM por sus siglas en inglés). Estas vías metabólicas tienen consecuencias importantes para las temperaturas óptimas de fotosíntesis (más altas en plantas C4 que en C3 por ejemplo), para la eficiencia de uso de agua y nutrientes, y para la respuesta a elevadas concentraciones de CO2. En comparación con las plantas C3 las plantas C4 tienden a ser más abundantes en ambientes cálidos, soleados y relativamente secos y/o salobres (por ej. en ecosistemas similares a sabanas tropicales). Las plantas CAM, por su parte, son generalmente muy conservadoras con el agua y se desarrollan predominantemente en ecosistemas secos y cálidos. Algunas plantas acuáticas sumergidas son CAM también. Hay especies que son CAM obligadas y otras que son facultativas, estas últimas pueden cambiar entre C3 y CAM dependiendo de factores ambientales (por ej. orquídeas epífitas en selvas de altura australiana).

Hay dos métodos principales de identificación de la vía metabólica fotosintética disponibles: la composición de isótopos de carbono y las observaciones anatómicas. Además, se puede confirmar que una planta es CAM de forma muy económica verificando que los estomas están abiertos de noche y cerrados durante el día, o midiendo patrones diurnos de ácidos orgánicos o valores de pH foliares. Qué método elegir (una combinación sería lo más confiable) depende de las facilidades o fondos disponibles, así como del objetivo del trabajo (por ej, para contrastar C4 vs. C3, o CAM vs C3). Aun cuando la composición de isótopos de carbono puede estar afectada por factores ambientales, las diferencias intraespecíficas genéticas y/o condiciones fenológicas, la variabilidad intraespecífica es lo suficientemente pequeña como para no interferir con la distinción entre las vías metabólicas C4 and C3. En muchas familias de plantas, sólo se encontró el metabolismo C3. Es de utilidad entonces saber en qué familias se han encontrado C4 y CAM. Las especies de esas familias pueden ser escaneadas sistemáticamente como potenciales candidatos para estas vías metabólicas (Ver Material Suplementario 4, Tabla 1). Más abajo describimos dos métodos que combinados proveen buen contraste entre tipos de vías metabólicas.


¿Qué recolectar y cómo hacerlo?

Recolectar las hojas totalmente expandidas o las estructuras fotosintéticas de plantas adultas, saludables y creciendo a plena luz del sol o tan cerca de la luz plena como sea posible. Recomendamos muestrear al menos tres hojas de tres individuos de tres plantas. Si se va a llevar a cabo análisis anatómicos (ver en B: Análisis anatómicos), almacenar al menos parte de las muestras frescas (ver 3.1)

(A) Análisis de isótopos de Carbono

Almacenamiento y procesamiento

Secar las muestras inmediatamente después de la recolección (ver protocolo en sección 3.1). Una vez seca, la muestra puede ser almacenada por largos períodos de tiempo sin que afecte su composición de isótopos. Si esto no es posible, la muestra podría ser almacenada primero en una atmósfera fría y húmeda (Ver 3.1.) o se puede colocar en el microondas y luego secar tan rápido como sea posible a 70-80°C para evitar pérdida de materia orgánica a través de la respiración foliar o descomposición microbiana. Las muestras pueden ser recolectadas de una porción de un espécimen de herbario, pero este procedimiento no es el más recomendado. Hay que tener en cuenta que los insecticidas y otras sustancias que puedan haberse utilizado para preservar el espécimen pueden afectar su composición isotópica.

Pesar las hojas o tejidos para cada planta, luego moler los tejidos secos cuidadosamente y pasarlos por un tamiz de 40 µm o más fino. A menudo es más fácil, si la muestra es muy pequeña, moler todo el material con un mortero de mano. Se necesitan sólo pequeñas cantidades de tejido para el análisis de isótopos de carbono. En la mayoría de los casos se utiliza menos de 3 mg de materia orgánica seca.


Mediciones

Los índices de isótopos de carbono en materia orgánica (δ13Choja) son medidos utilizando un espectrómetro de masa (IRMS, por sus siglas en inglés, con precisión entre 0,003 % y 0,3 %, dependiendo del tipo de IRMS utilizado) y son tradicionalmente expresados en relación con el PDB estándar como δ13C en unidades de por mil (‰), es decir partes por mil. Después de los análisis de isótopos, la vía metabólica fotosintética de las especies puede ser determinada basándose en lo siguiente (ver explicación gráfica en Material Suplementario 4, Figura 1)
Fotosíntesis C3 δ13C:                       -21 to -35 ‰
Fotosíntesis C4:                                 -10 to -14 ‰
CAM facultativa:                                   -15 to -20 ‰
CAM obligada:                                     -10 to -15 ‰

Debe tenerse en cuenta que separar plantas C3 o C4 de CAM basándose sólo en δ13C es difícil (para plantas CAM facultativas los valores de δ13C encontrados son de un rango tan amplio como de 14 a -23). Sin embargo, como regla general, si δ13C es entre -10 y -23‰, y el tejido fotosintético es suculento o las concentraciones de ácidos orgánicos son altos durante la noche, pero bajos durante el día, entonces asumimos que la planta es CAM. En esos casos serían decisivas observaciones anatómicas y mediciones diurnas de intercambio de gases o análisis bioquímicos (ver B. Análisis anatómicos).


(B) Análisis anatómicos

Las plantas C3 y C4 generalmente muestran diferencias consistentes en anatomía foliar, que se ven mejor en un corte transversal. Usando una hoja de afeitar o micrótomo, haga cortes transversales de las láminas de al menos tres individuos por especie, asegurándose de incluir algunas nervaduras regulares (las particularmente gruesas y prominentes, incluyendo la nervadura principal y las laterales más gruesas, no son relevantes). Las plantas C3 tienen hojas en donde, por lo general, todos los cloroplastos son esencialmente similares en apariencia y están distribuidos por todo el mesófilo (tejidos fotosintéticos). Las células del mesófilo no están concentradas alrededor de las nervaduras y usualmente están organizadas en “empalizada” o estratos “esponjosos” paralelos a, y respectivamente adyacentes a, las epidermis superior e inferior (Ver Material Suplementario 4, Figura 2). Verticalmente, las hojas de las plantas C3 a menudo tienen un estrato en palizada adyacente a cada epidermis y un estrato esponjoso entre las dos palizadas. Las células que rodean directamente las nervaduras (estructuras de transporte con floema de paredes delgadas y generalmente con células del xilema con paredes más gruesas), llamadas vaina vascular/haz vascular?, normalmente no tienen cloroplastos. Las plantas C4, en contraste, exhiben típicamente la “anatomía Kranz”. Concretamente, las nervaduras están rodeadas por un estrato distintivo de vainas vasculares (Material Suplementario 4, Figura 2) que suelen tener pared celular gruesa y tienen cloroplastos abundantes, a menudo agrandados, que contienen grandes gránulos de almidón. Las células del mesófilo están usualmente concentradas alrededor de las células de la vaina vascular, a menudo como un estrato simple cuyas células están orientadas radialmente en relación al centro de la nervadura, y contienen cloroplastos más pequeños sin gránulos de almidón. Estas diferencias pueden ser usualmente identificadas de manera sencilla bajo un microscopio de luz común. Muchos textos de fisiología y anatomía presentan ilustraciones más detalladas de anatomía Kranz vs anatomía C(Ver Más sobre métodos abajo).Si se observa anatomía Kranz, la especie es C4. En caso contrario, es posible que sea C3, a menos que la planta sea particularmente suculenta y pertenezca a alguna de las familias descriptas como posibles CAM. En este último caso pueden ser clasificadas como (posible) CAM. Muchas hojas CAM no tienen la empalizada de mesófilo esponjoso típicos de las plantas C3, sino sólo un estrato delgado de cloroplastos más o menos isodiamétricos justo debajo de su epidermis. En esos casos todo el centro de la hoja consiste en células parenquimáticas incoloras, grandes, de paredes delgadas que almacenan agua y ácidos orgánicos. En las plantas CAM los ácidos orgánicos (mayormente ácido málico) se acumulan durante la noche, y se degradan durante el día para proveer de CO2 para la fotosíntesis foliar, las especies CAM muestran un pH claramente más bajo después de la noche en comparación con la tarde. Debido a esto si las plantas vivas son de fácil acceso es recomendable evaluar el pH de una muestra de hojas frescas recolectadas al atardecer yluego machacadas en agua (ver 3.5), y repitiendo el procedimiento sobre la misma población en una nueva muestra recolectada antes del amanecer. Adicionalmente, las tasas de los isótopos de carbono pueden darnos más evidencia para distinguir entre CAM y metabolismos C3 o C4 (ver A. Análisis de isótopos de Carbono).


Casos especiales o extras

(i) Preparados permanentes o fotografías y visibilidad de cloroplastos. Existen numerosos métodos para hacer preparados microscópicos permanentes. Debe tenerse en cuenta que algunos de esos métodos pueden resultar en una pobre visibilidad de los cloroplastos. Un método para retener el color verde de los cloroplastos es remojar la planta o las hojas en una solución de 100 g de CuSO4 en 25 ml de formaldehido alcohol al 40 %, 1000 ml de agua destilada y 0.3 ml 10 % H2SO4 por dos semanas, luego en 4% formaldehido alcohol por una semana y enjuagar posteriormente con agua corriente por 1- 2 horas y almacenar en formaldehido alcohol hasta su uso. Sin embargo, el material tratado de esta forma puede ser seccionado solamente utilizando un micrótomo luego de incluirlo o congelarlo, en cambio, muchas hojas vivas, turgentes pueden ser seccionadas a mano alzada utilizando técnicas adecuadas como seccionar una hoja enrollada o una pila de muchas hojas. Las fotomicrografías de preparados de secciones frescas son una forma alternativa de mantener los registros para mediciones futuras.
 

Referencias sobre la teoría, significado y bases de datos: O'Leary (1981); Farquhar et al.(1989); Earnshaw et al. (1990); Ehleringer et al. (1997); Lüttge (1997); Zotz and Ziegler (1997); Wand et al.(1999); Pyankov et al. (2000); Sage (2001); Hibberd and Quick (2002).

Más sobre métodos: Farquhar et al.(1989); Ehleringer (1991); Hattersley and Watson (1992); Mohr and Schopfer (1995); Belea et al.(1998); Pierce et al. (2002); Taiz and Zeiger (2010).